Los enantiómeros del compuesto racémico forman complejos diastereoméricos con la sustancia quiral del relleno de la columna. Uno de los enantiómeros se enlaza con más fuerza que el otro, por lo que se mueve más lentamente a través de la columna.
La interacción diferente entre los diastereómeros y el relleno de la columna es la base de la cromatografía quiral. Un diastereómero interactuará más con el relleno de la columna, mientras que el otro diastereómero, que interactúa menos, puede pasar a través de la columna y salir de la columna primero.